Vad innehåller ett pcr test
PCRfrån engelskans polymerase chain reaction polymeraskedjereaktion är en molekylärbiologisk och biokemisk metod som används för att amplifiera ett exemplar eller ett fåtal kopior av en viss DNA-sekvens över flera storleksordningar, vilket genererar tusentals, och upp till miljontals exemplar av en enskild DNA-sekvens.
Metoden, som uppfanns av Kary Mullis år[ 2 ] [ 3 ] är numera en vanlig och ofta oumbärlig teknik som används i medicinska och biologiska forskningslaboratorier för en mängd olika tillämpningar [ 4 ] [ 5 ]. Dessa inkluderar kloning av DNA för sekvenseringDNA-baserad fylogeni och funktionell analys av gener för diagnostisering av ärftliga sjukdomaridentifiering av genetiska fingeravtryck som används för kriminaltekniska vetenskaper och faderskapstestersamt upptäckt och diagnostisering av infektionssjukdomar.
I metoden utnyttjas termiska cyklerdet vill säga cykler av upprepad uppvärmning och nedkylning för att denaturera DNA:t och sedan replikera det enzymatiskt. Primers korta RNA-fragment innehållande sekvenser som är komplementära till målregionen samt ett DNA-polymerassom metoden är uppkallad efter, är nyckelkomponenter för att möjliggöra en selektiv och upprepad amplifiering. Allteftersom reaktionen fortskrider kommer det DNA som genereras att användas som en mall templat för replikation, vilket startar en kedjereaktion där målsekvensen amplifieras exponentiellt.
En PCR kan modifieras i stor utsträckning för att kunna utföra ett brett spektrum av genetiska manipulationer. Nästan alla tillämpningar av PCR använder ett värmestabilt DNA-polymeras, till exempel Taq-polymeras ett enzym som ursprungligen isolerats från bakterien Thermus aquaticus. Den största majoriteten av PCR-metoder utnyttjar termiska cyklerdet vill säga omväxlade upphettning och nedkylning av PCR-provet i en definierad serie av temperatursteg.
I det första steget separeras de två strängarna i DNA-spiralen från varandra vid en hög temperatur i en vad innehåller ett pcr test som kallas denaturation. I det andra steget sänks temperaturen, och de två DNA-strängarna används som mallar templat av DNA-polymeras för att selektivt amplifiera målsekvensen. Selektiviteten hos PCR-metoden resulterar från användandet av primrar som är komplementära till den DNA-region som avses att amplifieras under specifika termiska betingelser.
PCR-test svar samma dag
De flesta PCR-metoder brukar amplifiera DNA-fragment mellan 0,1 och 10 kilobaspar kbpäven om vissa tekniker möjliggör amplifiering av fragment på upp till 40 kbp [ 7 ]. Mängden amplifierad produkt beror av mängden tillgängliga substrat som blir begränsande allteftersom reaktionen fortskrider [ 8 ]. Ett grundläggande upplägg för en PCR kräver flera komponenter och reagens [ 1 ].
Dessa komponenter innefattar:. En PCR utförs vanligen i små reaktionsrör om 0,5 ml i volymmed en reaktionsvolym på μl, som placeras i en termocykler.
Allt du beh철ver veta om PCR test
Termocyklern värmer och kyler reaktionsrören för att uppnå de temperaturer som krävs vid varje reaktionssteg. Många moderna termocykler använder sig av Peltier-effekten som, genom att byta riktning på den elektriska strömmen, kontrollerar både upphettning och nedkylning av vad innehåller ett pcr test som innehåller PCR-rören. De tunna väggarna i PCR-rören medför en gynnsam värmeledningsförmåga för att möjliggöra en snabb termisk jämvikt.
De flesta termocykler har uppvärmda lock för att förhindra att kondens bildas på toppen av reaktionsrören. Äldre termocykler som saknar uppvärmt lock kräver att ett lager olja placeras på toppen av reaktionsblandningen eller att en vaxboll placeras inuti röret. Vanligtvis består en PCR av en serie av upprepade temperaturförändringar, så kallade cykler, där varje cykel normalt omfattar oftast tre tydligt avgränsade temperatursteg.
Temperaturerna som används och den tid de tillämpas i varje cykel beror på en mängd parametrar. Dessa inkluderar det enzym som används för syntes av DNA, koncentrationen divalenta joner och deoxynukleosidtrifosfater i reaktionsblandningen och smälttemperaturen T m hos primrarna [ 11 ]. För att kontrollera att reaktionen genererade det förväntade DNA-fragmentet kallas ibland för amplikonet eller amplimeren kan agarosgelelektrofores utnyttjas för att separera PCR-produkterna efter storlek.
Covid-19 PCR-test
Reaktionen är mycket känslig: endast minutiösa mängder DNA behöver finnas tillgängliga i reaktionsblandningen. Utjämningsfas : Reaktionen bromsas när DNA-polymeraset förlorar sin aktivitet och när konsumtionen av reagens, såsom nukleotider och primrar, gör att de blir begränsande. I praktiken kan en PCR misslyckas av olika skäl, bland annat på grund av dess känslighet mot föroreningar som orsakar amplifiering av felaktiga DNA-produkter.
På grund av detta har ett antal tekniker och metoder utvecklats för att optimera förutsättningarna för PCR:r. Det innebär vanligtvis att uppställningsområdena för PCR:r separeras från områdena för analys eller rening av PCR-produkter, användning av engångsartiklar i plast och grundlig rengöring av arbetsytan mellan olika uppställningar och körningar [ 17 ]. Tekniker för design av primrar är viktiga för att förbättra produktutbytet och för att undvika bildandet av falska produkter.
Genom att använda alternativa buffertkomponenter eller polymerasenzymer kan amplifieringen av långa eller på annat sätt problematiska DNA-regioner potentiellt förbättras.
Vad är ett PCR-test? (pågående infektion)
Tillsatser av reagens såsom formamid i buffertsystem kan öka precisionen och utbyten för reaktionen [ 18 ]. Datorsimuleringar av teoretiska resultat elektronisk PCR kan utföras för att underlätta utformningen av primrar [ 19 ]. Andra tillämpningar av PCR innefattar sekvensering av DNA för att undersöka okända sekvenser som amplifierats via PCR där en av amplifieringsprimrarna kan användas för Sangersekvensering.
Den kan också användas för isolation av en viss DNA-sekvens för att främja rekombinanta DNA-tekniker som involverar insättning av en DNA-sekvens i en plasmidbakteriofag eller kosmid beroende på dess storlek eller i genomet hos en annan organism. Bakteriekolonier av till exempel E. PCR kan också användas för att identifiera genetiska fingeravtryck : en rättsmedicinsk teknik som används för att identifiera en person eller en organism genom att jämföra DNA-prover med olika metoder baserade på PCR.
Vissa metoder som används för att identifiera genetiska fingeravtryck med PCR har en hög urskiljande effekt och kan användas för att identifiera genetiska relationer mellan individer, såsom föräldrar och barn eller mellan syskon, och används ofta i faderskapsundersökningar. Tekniken kan också användas för att undersöka evolutionära relationer mellan organismer genom att analysera molekylära klockor det vill säga genen som kodar för 16S rRNA hos mikroorganismer [ 21 ].
Detta är ofta avgörande för kriminaltekniska vad innehåller ett pcr test när endast spår av DNA finns tillgängligt som bevis. Dessa tekniker, som baseras på PCR, har använts med framgång på djur såsom en fyrtio tusen år gammal mammutmen även på mänskligt DNA i tillämpningar som sträcker sig från analyser av egyptiska mumier till identifieringen av en rysk tsar [ 22 ]. Två primrar används med DNA som målmolekyl som beskrives ovan.
En enkel PCR-maskin för reglering av temperatur kan användas.